实验三 放线菌形态及菌落特征的观察-飞外

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第一篇:实验三 放线菌形态及菌落特征的观察

实验三 放线菌形态及菌落特征的观察

一、目的要求

掌握观察放线菌形态的基本方法,并观察放线菌的形态特征。

二、基本原理

和细菌的单染色一样,放线菌也可用石炭酸复红或碱性美蓝等染料着色后,在显微镜下观察其形态。放线菌的孢子丝形状和孢子排列情况是放线菌分类的重要依据,为了不打乱孢子的排列情况,常用印片染色法和(为人民服务是为了纪念谁而写的?毛泽东《为人民服务》的文章是为纪念张思德而写的。当时,抗日战争正处在十分艰苦的阶段,有许多困难需要克服。毛泽东主席针对这一情况,讲述为人民服务的道理,号召大家学习张思德同志完全彻底为人民服务的精神,团结起来,打败日本侵略者。)胶带纸粘菌染色法进行制片观察。

放线菌是由不同长短的纤细的菌丝所形成的单细胞菌丝体。菌丝体分为两部分,即潜入培养基中的营养菌丝(或称基内菌丝)和生长在培养基表面的气生菌丝。有些气生菌丝分化成各种孢子丝,呈螺旋形、波浪形或分枝状等。孢子常呈圆形、椭圆形或杆形。气生菌丝及孢子的形状和颜色常作为分类的重要依据。

三、器材

1.活材料:放线菌培养物,酵母菌斜面培养物;

2.染色液:复红染色液(或结晶紫,美兰);

3.器材:载玻片,胶带纸,小刀,接种环,吸水纸,擦镜纸,酒精灯,香柏油,乙醚-乙醇混合液,显微镜。

四、操作步骤

1.印片法:放线菌自然生长状态的观察

印片:取干净载玻片一块,用小刀切取放线菌培养体一块,放在载玻片上,用另一块载玻片对准菌块的气生菌丝轻轻按压,然后将载玻片垂直拿起。注意不要使培养体在玻片上滑动,否则会打乱孢子丝的自然形态;

微热固定:将印有放线菌的涂面朝上,通过酒精灯火焰2-3次加热固定; 染色:石炭酸复红染色1min; 水洗:水洗后晾干;

镜检:先用低倍镜后用高倍镜,最后用油镜观察孢子丝、孢子的形态及孢子排列情况。

2.胶带纸法

粘菌:用胶带纸在放线菌培养体上粘取菌体,注意,压取时从菌落边顺着菌体生长方向,避免从菌落上面压取,以免取得的全是孢子。

染色:将粘有菌体的胶带纸压在事先准备好的滴油染液的载玻片上。将多余染色液用滤纸吸掉。

镜检:同上。

五、实验报告

绘图说明你所观察到的放线菌的形态特征。

第二篇:3.霉菌、放线菌的形态观察 4学时

实验三

一、实验目的

霉菌、放线菌的形态观察

1. 学习并掌握观察放线菌、霉菌形态的基本方法。 2. 初步了解放线菌和四类常见霉菌的基本形态特征。

二、实验原理

1. 霉菌(真核微生物):

霉菌是一类可产生菌丝体的真核微生物的统称。霉菌的菌落形态较大,质地疏松,外观干燥,不透明,菌落与培养基间连接紧密,不易挑取,菌落正反面,边缘与中心的颜色、构造通常不一致,有霉味。霉菌的菌丝体分基内菌丝和气生菌丝,气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝,由繁殖菌丝产生孢子。霉菌菌丝体(尤其是繁殖菌丝)及包子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。

菌丝的孢子较大,在低倍镜下即可清晰观察到有隔或无隔菌丝和孢子及巨大的孢子囊。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比放线菌粗的多,常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍。霉菌菌丝较粗大,细胞易收缩变形,而且孢子很容易飞散,所以制标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液。此染色液制成的霉菌标本片特点是:(a)细胞不变形;(b)具有杀菌防腐作用,且不易干燥,能保持较长时间;(c)溶液本身呈蓝色,有一定染色效果。霉菌的菌丝、分生孢子梗和分生孢子的形态常作为分类的重要依据。

曲霉形态特征:表面灰绿色,菌体有许多复杂的分枝菌丝构成。营养菌丝具有分隔;气生菌丝的一部分形成长而粗糙的分生孢子梗,顶端产生烧瓶形或近球形顶囊,表面产生许多小梗,小梗上着生成串的表面粗糙的球形分生孢子。

根霉形态特征:匍匐菌丝弧形,无色,向四周蔓延。

放线菌形态特征:呈菌丝状生长,以孢子繁殖。显微镜下呈紫红色。 青霉形态特征:菌丝初期白色,颜色逐渐由白转变为绿或蓝,菌丝有隔膜。气生菌丝特化成子实体,子实体类型为分生孢子头。

霉菌的培养和观察方法:

(1)载玻片培养观察法:无菌操作将培养基薄层置于载玻片上,接种后盖上盖玻片培养,霉菌即在载玻片和盖玻片之间有限的空间内沿盖玻片横向生长。培养一定时间后,将载玻片上的培养物置于显微镜下观察,这种方法既可以保持霉菌自然生长状态,还便于观察不同发育期的培养物。

(2)玻璃纸培养观察法:与放线菌的玻璃纸培养观察方法相似,这种方法用于观察不同生长阶段霉菌的形态,也可获得良好的效果。

(3)直接制片观察法:用解剖针挑取少量培养物置于预先滴加乳酸石炭酸棉蓝染色液中,制成霉菌制片镜检。 2. 放线菌(原核微生物)

放线菌是由不同长短、纤细的菌丝所形成的单细胞菌丝体。菌丝体分为两部分,即潜入培养基中的营养菌丝(或称基内菌丝,简称基丝)和生长在培养基以上的气生菌丝(简称气丝)。有些气生菌丝分化成孢子丝,呈螺旋形、波浪形或分枝状等,孢子常呈圆形、椭圆形或杆状。能否产生气生菌丝及孢子的形状和颜色常作为放线菌分类鉴定的重要依据。

放线菌的菌落形态特征为:形成干燥、不透明、表面呈致密丝绒状,上有一层彩色“干粉”的菌落。菌落与培养基连接紧密,难以挑取,菌落正反面颜色不一致,在菌落边缘的琼脂平板上有变形的现象,有泥腥味。

放线菌只产生基丝而无气丝。放线菌的培养和观察方法:

放线菌在显微镜下一般气丝在上,基丝在下,气丝色暗,基丝较透明。有的(1)扦片法:在放线菌平板上扦上盖玻片后培养,使放线菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻片上。观察时用镊子拔出盖玻片,擦去背面培养物,将有菌的一面朝上置于载玻片上,直接镜检。

宜用略暗光线观察,低倍镜—高倍镜;染色后观察效果更好。

(2)玻璃纸法:玻璃纸是一种透明的半透膜,将灭菌的玻璃纸覆盖在平板表面,接种放线菌,经培养,放线菌在玻璃纸上形成菌苔。观察时先在载玻片上滴一小滴水,取下玻璃纸,使菌面朝上,使玻璃纸平贴于载玻片上。

优点:可观察到放线菌自然生长状态下的特征和不同生长期的形态。 注意:整过程勿触动菌面培养物。

(3)印片法:将要观察的放线菌的菌落或菌苔直接印在载玻片上,经染色后观察。该方法主要用于观察孢子丝的形态,孢子的排列及其形状等,但形态特征可能有所改变。

用接种铲或解剖刀将平板上的菌苔连同培养基一起切下,菌面朝上。另取一载玻片,微热后,轻轻按压菌苔,固定,染色后镜检。

三、实验器材

1. 菌种

放线菌划线平板28℃,3~5天后培养物;曲霉(Aspergillus sp.)、根霉(Rhizopus sp.)和青霉(Penicillium sp.)划线平板28℃,2~3天后培养物。

2. 仪器

显微镜、培养皿、载玻片、牙签、擦镜纸、吸水纸、染色缸等。 3. 试剂

乳酸石炭酸棉蓝染色液,石炭酸复红染液,生理盐水。

四、实验步骤 (一) 霉菌观察:

1. 霉菌自然生长状态下的观察:将培养3—4天的霉菌培养皿打开,放在显微镜低倍镜下寻找菌落的边缘,直接观察菌丝,分生孢子梗和分生孢子。

2. 直接制片染色观察:于洁净载玻片上,加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液,用牙签从霉菌菌落的边缘外(培养基平面下方一点儿)取少量带有孢子的菌丝置染色液中,再细心地将菌丝挑散开,然后小心地盖上盖玻片,注意不要产生气泡。置显微镜下先用低倍镜观察,必要时再换高倍镜。

注:挑菌和制片时要细心,尽可能保持霉菌自然生长状态;加盖玻片时勿压入气泡,以免影响观察。

可先将挑取的菌丝置于50%乙醇中浸一下以洗去脱落的孢子,然后置于染液中。 (二) 放线菌观察:

1. 放线菌自然生长状态下的观察

将培养3—4天的放线菌培养皿打开,放在显微镜低倍镜下寻找菌落的边缘,直接观察菌丝,孢子丝和孢子。

2. 印片法染色观察

(1)用接种铲或解剖刀(或牙签)将平板上的菌苔连同培养基切下一小块,菌面朝上放在载玻片中央。

(2)用另一洁净载玻片置火焰上微热后,盖在菌苔上,轻轻垂直按压,将其压碎,使培养物(气丝、孢丝或孢子)粘附在后一块载玻片中央,弃去培养基,制成涂片,将有印迹的一面朝上,通过火焰2~3次固定。

注:不能压碎培养基,也不能将孢子或菌丝压入培养基。

(3)用石炭酸复红染液或吕氏碱性美蓝染液覆盖印迹,染色0.5~1分钟后水洗。

(4)干燥后,用油镜观察营养菌丝,孢子丝及孢子的形态。

五、实验结果

绘图说明所观察到的青霉和放线菌主要形态特征。 六 思考题

1. 镜检时,如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝?

2. 显微镜下,细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的主要区别是什么? 补充材料:

1. 霉菌对人类生活和生产能产生哪些积极作用和消极作用?

答:霉菌分布极其广泛,只要存在有机物就有它们的踪迹。它们在自然界扮演者最重要的有机物分解者的角色,从而把其他生物难分解利用的数量巨大的复杂有机物如纤维素和木质素彻底分解转化,称为绿色植物可以重新利用的养料,促进了整个地球上生物圈的繁荣发展。

积极作用:(1)工业上的柠檬酸、葡萄糖酸、淀粉酶、蛋白酶等酶制剂,青霉素、头孢霉素等抗生素,核黄素等维生素,麦角碱等生物碱,真菌多糖、赤霉素等产物的发酵生产;利用Absidia(犁头霉)等对兹体化合物的生物转化以生产兹体激素类药物;以及利用霉菌在生物防治、污水处理和生物测定等方面的应用;(2)在食品制造方面,如酱油的酿造和干酪的制造等(3)在基础理论研究方面,霉菌是良好的实验材料

消极作用:(1)大量真菌可引起工农业产品霉变(2)是植物最主要的病原菌,引起各种植物的传染性病害,如马铃薯晚疫病,稻瘟病和小麦锈病等(3)引起动物和人体传染病,如皮肤廯病症等;另有少部分霉菌可产生毒性很强的真菌毒素,如黄曲霉毒素。

2. 在自然界和实际应用中放线菌有什么作用?

答:实际应用: (1)产生抗生素;

(2)近年来筛选到的许多新的生化药物多数是放线菌的次生代谢产物,包括抗癌剂、酶抑制剂、抗寄生虫剂和农药杀虫剂等;

(3)放线菌还是许多酶、维生素的产生菌;

自然界:放线菌在兹体转化、石油脱蜡和污水处理中也有重要作用。由于很多放线菌有极强的分解纤维素、石蜡、角蛋白、琼脂和橡胶等的能力,故它们在环境保护、提高土壤活力和自然界物质循环中起着重大作用。

第三篇:放线菌霉菌的制片观察

实验三 放线菌霉菌的制片观察

实验目的:

1. 学会用印片法制作临时装片

2. 掌握用显微镜观察放线菌个体形态特征的方法 3. 掌握霉菌的观察方法和观察霉菌的形态特征 实验原理:

1. 放线菌是产生抗生素的重要微生物种类之一,其形态特征含有3个部分,基内菌丝、气生菌丝和孢子丝。基内菌丝:升展于培养基的表面和内部,菌丝色淡、较细。气生菌丝:在基内菌丝上,升展于空间,颜色较深,菌丝较粗。孢子丝:菌丝成熟时,大部分气生菌丝分化成孢子丝,孢子丝形态多样,由成串分生孢子组成。

2. 霉菌是真核生物主要有基内菌丝、气生菌丝和繁殖菌丝。基内菌丝:升展于培养基的表面和内部。气生菌丝:在基内菌丝上,升展于空间。繁殖菌丝:产生孢子。 材料和仪器:

1. 菌种:细菌链霉菌、霉菌 2. 培养基:高氏一号琼脂培养基

3. 器皿:培养皿、盖玻片、载玻片、镊子、显微镜等 4. 染液:吕氏美兰染液、乳酸石碳酸棉兰染液 实验步骤:

1. 配制培养基灭菌后倒平板,待起冷却后划线接种,在培养箱内培养5-7天

2. 取盖玻片印于放线菌菌体处,轻轻敲打后取出置于有吕氏美兰染液的载玻片上,无菌操作

3. 用镊子夹取少量霉菌菌体于有乳酸石碳酸棉兰染液的载玻片上,用大头针打散菌体,盖上盖玻片吸取多余的染液,无菌操作

4. 取制作好的临时装片于显微镜下,镜检,观察放线菌和霉菌的形态特征 实验结果:

1. 放线菌所获临时装片材料较少,只有几个视野可以观察的到菌体,菌体疏松。因为放线菌长势不好,只有少数生长于培养基上,故取材时只取到少部分,但不影响观察,可以清晰的看到菌丝体和孢子丝,说明放线菌有菌丝体和孢子丝组成,孢子丝呈串珠状。 2. 霉菌制作了两块临时装片,第一个观察到的都是圆形小颗粒的孢子,说明取材时,仅仅只取了培养基表面的一层菌体,没有深入培养基中取菌体,操作有误。第二块可以清晰的看见霉菌菌体,其中有分生孢子梗、顶囊、小梗、分生孢子,说明霉菌由这几部分组成,孢子着生于小梗上,呈串珠状。霉菌菌体比放线菌菌体大很多。

第四篇:放线菌图片

图2-3 2001-1197气生菌丝(1000×) Fig.2-3 Aerial mycelium of 2001-1197(1000×)

A

B

C

图2-4 2001-1197孢子丝及孢子 A:1000×;B:2000×;C:5000×

Fig.2-4 Aerial mycelium with spores of 2001-1197

A: 1000×; B: 2000×; C: 5000×

高氏一号琼脂培养基,20天

葡萄糖天冬素琼脂培养基,20天

苹果酸钙琼脂培养基,20天

燕麦粉琼脂培养基,20天

葡萄糖酵母膏琼脂培养基,20天

酪氨酸琼脂培养基,20天

柴斯纳琼脂培养基,20天

马铃薯块培养基,20天

图2-5 菌株2001-1197的培养特征

Fig.2-5 Culture characteristics of Strain 2001-1197

第五篇:实验二_____土壤中放线菌的分离

实验讲义5 土壤中枯草芽孢杆菌分离方法

取土样时最好选取如花坛等地方的土样,去掉表层5~10cm的土壤后取样。

放入100ml三角瓶中,加入30ml水,常压加热至水沸腾后维持20min,取出,置28-37摄氏度培养24-48h,液面则产生黄白色皮膜。 用接种环取皮膜适量于无菌水中分散,稀释涂布于蔗糖豆芽汁琼脂平皿,置28-37摄氏度培养24-48h,挑取典型菌落。

实验6

土壤中放线菌的分离(实训)

实验目的:1掌握配制合成培养基的一般方法。

2掌握稀释倒平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。 3掌握平板划线法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。 4掌握涂布平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。

实验材料:

药品:可溶性淀粉、KNO

3、NaCl、K2HPO4•3H2O、MgSO4•7H2O、FeSO4•7H2O、琼脂。 其他:高压蒸汽灭菌锅、扭力天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、硫酸纸、线绳、无菌培养皿、铁锹、小铲、酒精棉球、镊子、玻璃铅笔。

实验原理:

高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基,高氏一号培养基:碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO3 、NaCl 、K2HPO4•3H2O 、MgSO4•7H2O 作为无机盐,FeSO4•7H2O作为微生物的微量元素,提供铁离子等组成。

放线菌是重要的抗生素产生菌,主要分布在土壤中,其数量仅次于细菌,一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体,为了研究某种微生物,就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来,从而获得某一菌株的纯培养。分离放线菌常用稀释倒平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求,常选用合成培养基或有机氮培养基。如果培养基成分改变,或土壤预先处理(120℃热处理1h),或加入某种抑制剂(如加数滴10%酚等),都可以使细菌,霉菌出现的数量大大减少,从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法,使放线菌在固体培养基上形成单独菌落,并可得到纯菌株。

实验步骤:

1.高氏一号合成培养基的制备

高氏一号琼脂培养基(培养放线菌用)

可溶性淀粉20g,硝酸钾1g,氯化钠0.5g,K2HPO4 •3H2O 0.5g,MgSO4•7H2O 0.5g,FeSO4•7H2O 0.01g,琼脂20g,水1000ml,pH7.2~7.4。

配制时,先用冷水,将淀粉调成糊状,倒入煮沸的水中,在火上加热,边搅拌边加入其他成分,溶化后,补足水分至1000ml。112℃灭菌20分钟。

2. 土壤中放线菌的分离 (1)待测样液的制备

选定取样点(最好是有机质含量高的菜地),按对角交叉(五点法)取样。先除去表层约2cm的土壤,将铲子插入土中数次,然后取2~10cm处的土壤。盛土的容器应是无菌的。将5点样品约1kg充分混匀,除去碎石、植物残根等,土样取回后应尽快投入实验。

称土样1g于盛有99mL无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的三角瓶中,振荡10~20min,使土样中的菌体、芽孢或孢子均匀分散,此即为10-2浓度的菌悬液,静置30s。另取装有9ml无菌水的试管3支,编号10-

3、10-

4、10-5。用无菌吸管无菌操作取10-2浓度的土壤悬液1ml并加入编号10-3的无菌试管中,并吹吸吸管2~3次,使与9ml水混匀,即为10-3浓度的土壤稀释液。依此类推,直到稀释至10-5的试管中(每个稀释度换1支无菌吸管)。稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行。 (2)稀释倒平板法分离土壤中放线菌

-5-4-5-4取2支1毫升移液管分别从

10、10菌悬液中吸取1毫升菌悬液,分别注入编号

10、10的培养皿内。将温度为45~50℃的高氏一号培养基倒入上述各培养皿内,轻轻旋转使菌悬液充分混合均匀,凝固后,将培养皿倒扣放置在温暖处(28℃左右),每天观察培养基表面有无微生物菌落。 (3)涂布平板法分离土壤中放线菌

取2套无菌平皿,在皿底贴上标签,注明土壤稀释液的稀释度(10-

4、10-5)、组别、姓名、操作日期等。每个稀释度做一个培养皿。然后在每皿中倒入已溶化并冷至50℃左右的高氏一号培养基15~20ml左右,待冷凝成平板。

用无菌吸管从浓度最小稀释液开始,每次吸取0.1ml加到一组相应编号(10-5)的高氏一号平板上(每次吸取前,吸管要在液体内吹吸几次),再依次将10-4的土壤稀释液加到相应平板上。用无菌刮棒(从浓度小的稀释液开始)将加入平板培养基上的土壤稀释液在整个平板表面涂匀。 (4)平板划线法分离土壤中放线菌

取一培养皿置于实验台上,左手将培养皿打开稍许,向培养皿内注入熔化的营养固体培养基10~12毫升,轻轻转动培养皿,使其中的培养基分布均匀,平放桌上,使其凝成平板。然后在皿底用蜡笔划分A、B、C、D几个区。每组两个平板培养基。

将培养皿底部用姆指和无名指固定成倾斜状态,在火焰旁将培养皿稍微打开。在此同时,用环状接种针在火焰旁取少许10-2浓度的土壤稀释液,迅速送入培养皿内,在平板培养基的一边,作第1次平行划线 6~7条,转动培养皿约70°角,用烧过冷却的接种针,通过第1次划线部分作第2次平行划线,然后再用同样方法,作第3次平行划线。划线时,接种针应与平板表面成30°角左右。不要使接种针碰到培养皿边缘,也不要将培养基划破。 (5)培养

接种完毕,将平皿放入28℃恒温箱培养7天,观察平皿上放线菌(主要是链霉菌)菌落。 (6)挑菌落

待三种方法的平板长出菌落后,鉴定微生物类群,并根据镜检结果,判断是否已分离到了纯菌种。如果菌种很纯,则可转移到斜面培养基上进一步培养。转种至斜面,菌种用牛皮纸包好,置4℃冰箱中保存。

准备实验内容:

问曾老师借 无菌刮棒 打火机 酒精灯

无菌报纸包(1个)

99mL水/三角瓶(玻璃珠)

5支移液管 3支9mL水的试管

培养皿6套 枪头(1mL/0.1mL)

高氏一号培养基500mL(150mL三角瓶2个,200mL试管) 思考题:

1.检查接种后培养物的生长情况和染菌情况。

2.观察与记录以下内容。

大小

形状

边缘颜色

表面代谢物

种类 3.如何区分放线菌和真菌、细菌?

放线菌菌落小而紧密、干燥、不透明、难以挑取,当大量孢子覆盖于菌落表面时,就形成表面为粉末状或颗粒状的典型放线菌菌落,由于基内菌丝和孢子常有颜色,使得菌落的正反面呈现出不同的色泽。霉菌菌落的话应该是比较大的,可能是大而疏松也可能大而紧密,其他一些跟放线菌都差不多,比如都是颜色多种多样,与培养基紧密结合难于挑取。但在气味上有很大差别,放线菌具有泥腥味,而霉菌具有霉味。还有一点就是放线菌菌落周围琼脂平面会有变形的现象。若稀释平板的稀释度不够,放线菌会被抑制了或者菌落太小,而其他细菌的菌落又太多,不容易找到。


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