lncrna引物设计(CRISPR/Cas9敲除LncRNA或者外显子的效率是多少?)-飞外

LNRNA引物设计(CRISPR/Cas9)敲除LNRNA或外显子的效率如何?)

经常有小伙伴问CRISPR/Cas9系统敲除整个外显子或lncRNA的效率有多高,是否与敲除片段的大小有关?为了回答这个问题,我想和大家分享一篇验证淘汰制效率的文章。

2014年在JBC发表了题为《哺乳动物细胞中簇状规则间隔回文重复(crispr)/cas9核系统介导的基因组缺失效率的表征》的文章,NCBI显示该文章已被引用154次。

为了研究CRISPR/Cas9介导的基因组片段敲除的效率,本文设计了一系列配对的sgRNA来敲除长度为1.3kb到1MB的基因组片段(图1)。这些片段有的位于外显子区,有的位于内含子区,有的位于基因间区。而且所有编辑过的基因都与细胞增殖无关。

图1。成对sgRNA靶标的设计

在配对的sgRNA设计中,虽然有可能敲除sgRNA的两个中间片段,但也可能在不缺失的情况下原位修复。为了检测特异性结果,作者在不同靶标附近设计了几对引物。

图2。用于维修结果分析的底漆设计

在开始检测该细胞是否存在等位基因敲除时,使用了图2中的两对蓝色和红色引物,红色引物位于两个sgrna之间,蓝色引物位于两个sgrna之外。这时,有三种情况。之一,如果红色引物PCR在DNA凝胶中没有条带,而蓝色引物PCR有条带(如果蓝色引物中段太长,无法扩增产物,PCR就无法扩增产物),说明是纯合敲除。其次,如果红色引物PCR有条带,蓝色引物PCR也有条带,说明杂合子被敲除了。第三,如果红色引物PCR有条带,而蓝色引物PCR没有条带,说明没有发生敲除。

但对于带条带的红色引物PCR产物,还有另一种情况需要分析,即sgRNA的两个中间片段是否发生了反向。因此,作者在图2中设计了以下两对绿色和紫色引物来扩增sgRNA靶及其相邻序列。如果引物1和2以及引物3和4在PCR中有条带,则意味着没有反转;如果引物1和3以及引物2和4具有条带,这意味着中间片段是反向的。

图3。成对sgRNA切除基因片段的效率

从17对sgRNA中筛选出1974个克隆,最终检测出278株单克隆细胞系。根据等位基因分析,在278个细胞中有556个等位基因。19/556 (26.8%)个等位基因中间片段被删除,72/556(12.9%)个等位基因中间片段被逆转,其余60%在Cas9的切割位置被原位修复而未被删除。在做外显子敲除时,等位基因反转的情况也是可以考虑的一种基因编辑 *** 。总体来看,等位基因倒位加缺失的比例接近40%。然而,对于敲除lncRNA,由于不确定反转是否会使其功能失活,lncRNA不建议在后续实验中使用反转克隆。

根据细胞株分析,31/278(11.2%)的细胞为双等位基因缺失细胞,2/278(0.7%)的细胞为双等位基因倒位细胞。26/278(9.4%)细胞有一个等位基因缺失,一个等位基因逆转。61/278(21.9%)细胞的一个等位基因被敲除,另一个等位基因在Cas9切割位点被原位修复。在39/278(14.1%)细胞中,一个等位基因被逆转,另一个等位基因在Cas9切割位点被原位修复,而两个等位基因既不缺失也不逆转的细胞比例为119/278(42.8%)(图3)。

综合所有数据后,本文进一步分析了敲除片段长度与敲除效率的关系(根据等位基因分析),得出敲除效率与敲除长度负相关的结论(图4)。可以看出,当敲除片段小于23kb时,敲除效率基本在10%以上,甚至很多片段的敲除效率在20%甚至30%以上。

除了击倒效率的信息,文章中还有一些细节值得关注。首先,精确删除6/40(15%)双等位基因敲除细胞;27/87(31%)的单等位基因敲除细胞被精确敲除。此外,目前认为野生spCas9的切割位点位于靶标第17、18位的中间,切割产生平端。所谓精确敲除是指两个cas9的切割序列直接相连,中间不缺失或插入其他序列。其次,对于没有精确删除的细胞,由于两个平端通过NHEJ修复进行修复,经常会引入一些indes,这些indes的长度大多集中在-10bp-0bp(减号代表删除,加号代表插入)。第三,对于双等位基因敲除细胞,对其中部分细胞进行了之一代测序,发现22/31(71%)细胞的两个等位基因之间的indel序列相同,9/31(29%)细胞的两个等位基因的indel片段不同。

如果你把这里的之一点和第三点结合起来,你会发现一些有趣的NHEJ内容。例如,如此高的精确修复率表明,在NHEJ修复过程中很有可能不会引入indel。另一个例子是,高百分比的纯合子缺失(相同的indel)表明可能存在根据模板修复NHEJ的可能性。

注:低阳性率细胞筛选 *** 的优化

对于超过1MB(1000kb)的片段缺失,即染色体水平的基因组大片段缺失,本文筛选比例为4/339,略超过1%。还有其他文章筛选后基本都是1%。如果我们筛选单克隆细胞系,如此低的比例是一项非常大的工作。而且,1%并不意味着100个细胞中就一定会有一个被筛选出来。被各种游戏厂商骗过抽卡的同学可能更能理解什么是非酋长。所以这里给大家介绍一种 *** ,在有限稀释时可以用每孔5-10个细胞稀释,用流式细胞仪每孔接种5-10个细胞。当我们在这些孔中检测到阳性细胞后,我们可以用这个孔中的细胞选择单克隆抗体一次,第二次选择单克隆抗体的阳性率将直接上升到10%-20%。在两种情况下,我们推荐上述 *** :之一,敲除片段大于1000kb其次,敲除片段小于1000kb,PCR验证有阳性细胞,但多次单克隆选择后未发现阳性克隆。